作者：石文霞，周红，李娜，黄宏亮，周保成    作者单位：江苏大学基础医学与医学技术学院，镇江 212013
【摘要】  目的 探讨凝血FⅦa、Ⅹ、Ⅱa在蛋白酶激活受体2（PAR2）活化及诱导SW 620细胞IL-8表达中的作用。方法 用PAR2激动剂（PAR2AP）、FⅦa、Ⅹ、Ⅱa等不同刺激物处理SW 620细胞，以ELISA法检测细胞上清IL8水平，以实时定量PCR检测细胞IL8 mRNA表达。结果 血浆浓度的Ⅶa需在FⅩ存在下才能促进细胞IL8表达；单克隆抗TF及抗PAR2抗体均可抑制FⅦa的作用；FⅡa轻微下调细胞IL8表达，Hirudin、抗PAR1及抗PAR2抗体均可阻断此作用。结论 TFFⅦa及TFFⅦaFⅩa复合物，而非FⅡa，活化PAR2上调SW 620细胞IL8表达，从而促进细胞增殖及迁移。
【关键词】  蛋白酶激活受体2(PAR2)； 因子Ⅶa； 白介素8(IL8)； 结肠癌细胞株SW 620
Activation of ProteaseActivated Receptor 2 by FⅦa Induced IL8 Expression in SW 620 Cells Depending on TF and FX  SHI Wenxia, ZHOU Hong, LI Na, HUANG Hongliang, ZHOU Baocheng    (Schoolof Medical Science and Laboratory Medicine，Jiangsu University,Zhenjiang 212013， China)
    Abstract： Objective  To investigate the roles of FⅦa，Ⅹ and Ⅱa on proteaseactivated receptor2 activation and IL8 expression in SW 620 cells.  Methods  The effects of PAR2AP, FⅦa，Ⅹ，Ⅱa on IL8 protein and mRNA expression in SW 620 cells were analysed by ELISA and QTPCR.  Results  Plasma concentration of FVIIa combined with FⅩ could induce IL8 expression in SW 620 cells. The effects of FVIIa could be blocked not only by antiTF but also by antiPAR2 antibody. FⅡa showed slightly downregulation on IL8 expression, and could be attenuated with Hirudin, antiPAR1 or antiPAR2 antibody.  Conclusion  TFFVIIa and TFFVIIaFXa complex, but not FIIa, may activate PAR2 and then induce IL8 expression in SW 620 cells, which promotes the growth and migration of cancer cells.
    Key words：  Proteaseactivated receptor 2 (PAR2); Factor VIIa; Interleukin8 (IL8); colon cancer cell line SW 620
    蛋白酶激活受体(PARs)是一种与G蛋白相偶联、7次跨膜单位的受体家族。已知该家族有四个亚型：即PAR1、PAR2、PAR3和PAR4,可表达于多种组织细胞。PAR1、3和4是凝血酶受体，主要参与血液凝固、血小板活化等。PAR2不能被凝血酶激活，而被多种其他蛋白酶活化，包括胰蛋白酶、凝血FⅦa、Ⅹa等[1]。研究发现PAR2可表达于多种肿瘤细胞,但对肿瘤作用的机制仍未阐明。就其激活途径，是否FⅦa及Ⅹa为肿瘤细胞PAR2有效的激动剂？FⅦa是直接活化PAR2，还是由TFFⅦa水解活化凝血FⅩ生成FⅩa的途径活化PAR2？白介素8（IL8)是趋化因子家族成员之一,最初表现为对炎性细胞的激活和趋化，在炎症损伤中起重要作用。现研究发现它还具有促有丝分裂与血管生成的作用,并与多种肿瘤的浸润、转移及预后相关[2]。本研究组前期工作发现TF及PAR2高表达于结肠癌细胞株SW 620，PAR2激动剂及FⅦa均可促进细胞增殖、迁移及分泌IL8[34]。本文进一步探讨不同浓度FⅦa对SW 620细胞PAR2的激活及IL8表达的影响，以及是否依赖TF及FⅩ。
    1  材料与方法
    1.1  材料  细胞培养用DMEM和胰蛋白酶为Gibco公司产品。超级新生牛血清购自杭州吉诺公司。重组人凝血FⅦa、Ⅹ、Ⅱa、水蛭素（rhirudin）、单克隆鼠抗人TF抗体(αTF)购自ADI公司（美国）。单克隆鼠抗人PAR1、PAR2抗体（αPAR1,αPAR2）购自ZYMED公司（美国）。PAR2激动剂（PARAP,SLIGKVNH2）由武汉蛋白技术公司合成。人IL-8测定试剂盒（ELISA）购自Boatman BIOTECH公司（中国）。Trizol与RTPCR试剂购自Invitrogen(美国)。
    1.2  方法
    1.2.1  细胞培养  人结肠癌细胞株SW 620由上海细胞生物研究所提供。细胞培养选用含有10%新生牛血清的DMEM,置于37℃、5%CO2的孵育箱(Forma Scientific公司)中培养。待细胞长满培养瓶底部70%时,消化传代，取传代3～10次的细胞用于实验。
    1.2.2  ELISA测定细胞培养上清IL8水平  收集SW 620细胞，用含0.1%BSA无血清DMEM培养基洗涤3次,并重悬细胞，计数。将SW 620细胞种于24孔板内，5×105个/孔,根据需要将细胞与相关抗体（10 μg/ml）预先孵育1 h，然后用PAR2AP（不同浓度）、FⅦa(不同浓度)、FX(100 nM)、FⅡa(1 u/ml)等处理细胞一定时间，收集细胞培养上清。选用商品化试剂盒测IL8含量,为经典酶联免疫吸附测定法(ELISA),操作按说明书，结果以pg/ml表示。
    1.2.3  实时定量PCR检测细胞IL8 mRNA  6孔板内培养SW 620细胞，浓度为1×106/孔，经无血清饥饿培养过夜后，根据需要细胞分别以PAR2AP（100 μM）、FⅦa(10 nM)处理相应时间。采用Trizol试剂提取细胞总RNA并逆转录成cDNA。分别设计IL8及GAPDH(参照)基因的引物序列（上海生工合成），见表1，定量PCR分析仪（Rotor gene 2000,澳大利亚Corbett Research公司）检测细胞IL8 mRNA及GAPDH mRNA水平。反应体系为：10×PCR缓冲液2.5 μl，cDNA模板0.5 μl，25 mM dNTPs 2.0 μl，25 mM MgCl22.0 μl，上下游引物各0.5 μl(10 pM)，rTaq聚合酶0.2 μl(5 u/μl),SybergreenⅠ(1∶1000)1 μl，用灭菌ddH2O补足至25 μl。PCR循环参数为：94℃预变性5 min，一个循环；94℃ 30 s，60℃(IL8)/56℃ (GAPDH)30 s，72℃ 30 s,35个循环扩增。以IL8 mRNA与GAPDH mRNA比值分析结果。表1  IL8和GAPDH基因引物序列
    1.2.5  统计学分析  全部统计分析均采用SPSS(Version 10.0),所有数据以x±s表示。对各组数据进行成组t检验,P<0.05具有统计学意义。
    2  结    果
    图1  PAR2AP对SW 620细胞IL8表达的作用    PAR2AP(100 M)作用细胞不同时间IL8蛋白（A）及mRNA表达（C）；不同浓度PAR2AP作用细胞24 h的IL8蛋白表达（B）*：与空白对照比较P＜0.05；**：与空白对照比较P＜0.01。2.1  PAR2AP对SW 620细胞表达IL8的影响  PAR2AP是人工合成的活化PAR2的特异性肽衍生物，本研究组前期工作发现一定剂量的PAR2AP可激活SW 620细胞PAR2，诱导细胞IL8表达[3]。本实验再次选用PAR2AP作为PAR2激活的对照，并深入探讨了PAR2AP的有效作用时间与浓度。结果显示,PAR2AP促进细胞IL8表达具有时效关系，PAR2AP作用12 h后细胞上清IL8蛋白含量增加，于36至48 h到达高峰平台，随后下降（图1A所示）。而IL8 mRNA表达高峰在PAR2AP作用细胞24 h(图1C)。另外，PAR2AP对细胞的作用也呈浓度依赖性，图1B显示25 μM的PAR2AP作用细胞24 h即出现IL8表达上升，随PAR2AP浓度增加IL8表达量也增加，100 μM PAR2AP可显著激活细胞表达IL8。
    2.2  凝血因子Ⅶa对SW 620细胞分泌IL8的影响  图2显示了不同浓度FⅦa或/和FⅩ、以及抗TF、抗PAR2抗体条件下对SW 620细胞IL8表达的结果。由图2A可见：血浆浓度（100 pM）、甚至10倍血浆浓度（1 nM）的Ⅶa单独作用均不能有效促进细胞IL8分泌，而在100 nM因子Ⅹ(血浆浓度)存在下具有促进效应。更高浓度（10 nM）FⅦa单独作用即可显著促进细胞IL8表达，加入因子Ⅹ则不能增加效应。接着观察了抗TF、抗PAR2抗体对FⅦa作用的影响，图2B显示αTF(10 μg/ml)和αPAR2(10 μg/ml)均可阻断FⅦa（10 nM）的作用，进一步证明FⅦa是通过TF（TFFⅦa）作用于PAR2。另外，尽管αTF阻断了TFFⅦa激活PAR2，FⅦa还是能够使FⅩ转化FⅩa，后者也能活化PAR2，导致细胞IL8分泌增加，αPAR2能够阻断此作用。
    2.3  凝血因子Ⅱa对SW 620细胞分泌IL8的影响  为探明TFⅦa是否通过凝血途径生成FⅡa,由FⅡa活化相关PARs诱导信号转导，从而影响细胞功能，本实验中使用了FⅡa及相关抑制物，观察对细胞分泌IL8的作用。结果见图3：与对照比较，FⅡa(1 U/ml)部分下调了SW 620细胞IL8表达，rhirudin(1 U/ml)、αPAR1或αPAR2(均为10 μg/ml)均能阻断FⅡa的作用,使细胞IL8表达回升。
    3  讨    论
    PAR2分子由395个氨基酸组成，分为细胞外区(N末端和细胞外袢)、跨膜区(7个跨膜螺旋)及细胞内区(细胞内袢和C末端)。其C末端与受体脱敏和信号转导有关，N末端则有相应的蛋白酶裂解位点，与受体激活关联。PAR2AP是人工合成的活化PAR2的特异性肽衍生物（SLIGKVNH2），常被用于PAR2研究。本次研究表明：100 M的PAR2AP作用SW 620细胞24 h，能够使细胞显著表达IL8 mRNA及蛋白（图1）。
    研究报道，凝血因子Ⅶa、Ⅹa均能活化PAR2，而FⅡa不能与PAR2结合。本研究前期工作发现结肠癌细胞株SW 620能够高表达TF及PAR2（基因与蛋白水平），无明显PAR1蛋白表达。是否血浆浓度的因子Ⅶa和FⅩa为SW 620细胞PAR2的有效激活剂？机体正常血浆内以酶原形式存在的因子Ⅶ、Ⅹ分别约为10 nM和174 nM，而FⅦa浓度约为100 pM[5]。本研究结果显示，血浆浓度（100 pM）乃至10倍血浆浓度（1 nM）的FⅦa单独使用并没有活化PAR2而诱导细胞IL8分泌，而当因子Ⅹ存在的条件下具有效应。更高浓度（10 nM）FⅦa单独作用即可显著促进细胞IL8表达，此时加入FⅩ则不能增加效应。提示低浓度Ⅶa主要以TFFⅦaFⅩa复合物形式作用PAR2，高浓度FⅦa则不需要FⅩa，仅TFFⅦa就足以活化PAR2。本研究进一步验证了FⅦa必须与细胞膜TF结合（TFFⅦa）才具有作用，抗TF及抗PAR2抗体均能阻断FⅦa的效应，这一结论与国际报道相符。Camerer等[5]采用siRNA干扰爪蟾卵细胞TF表达后，即使高浓度的FⅦa（300 nM)也不能有效活化PAR2诱导相关信号转导。抗体阻滞实验进一步发现，尽管αTF阻断了TFFⅦa激活PAR2，FⅦa还能够使FⅩ转化FⅩa，由FⅩa活化PAR2，导致细胞IL8分泌增加。
    虽然有报道FⅡa是PAR1的有效活化剂而不能直接活化PAR2,但TFFⅦa凝血作用途径最终可产生FⅡa，FⅡa在SW 620细胞IL8表达方面究竟有何影响？本研究进行了初步探讨。结果发现，FⅡa（1 U/ml）使SW 620细胞的IL8基础表达下降，FⅡa抑制剂Hirudin、αPAR1或αPAR2均可阻断FⅡa的作用，提示FⅡa可能通过PAR1、并交错涉及PAR2或其他受体影响SW 620细胞功能。有研究表明PAR1、PAR2、PAR3、PAR4四种受体间存在复杂的相互调控作用。例如，PAR4与FⅡa亲和力低，PAR4的活化必须借助PAR3先锚定于FⅡa。PAR3与PAR1共表达于人血管内皮细胞，并可能起到调节其他PARs的作用。转导结构域缺陷的PAR1可以活化PAR2[6]。本研究组前期工作也发现SW 620细胞虽然PAR1蛋白表达不明显，却有PAR1 mRNA表达。因此，本实验中FⅡa的作用可能与PAR1及PAR2的交错联系相关，需要进一步探讨。
    IL8作为一种趋化因子，通过2个细胞膜受体（CXCR1和CXCR2）发挥生物学效应，除表达于白细胞表面外，还表达于某些癌细胞和新生血管内皮细胞上，具有促有丝分裂与血管生成的作用,与多种肿瘤的浸润、转移及预后密切相关。有报道肿瘤细胞表达IL8及其受体CXCR2可促进细胞突破血管内皮细胞屏障发生迁移,siRNA干扰CXCR2表达后，细胞迁移能力明显下降[7]。用IL8 cDNA转染前列腺癌细胞可促进细胞迁移，侵袭，MMP9及VEGF表达的能力[8]。因此，本研究重点将IL8表达作为SW 620细胞PAR2激活的观察指标。除IL8外，Liu等[9]发现，TFFⅦa活化PAR2后促进乳腺癌细胞表达VEGF，促进肿瘤血管生成。Darmoul等[10]研究表明,PAR2活化后可以诱导结肠癌HT29细胞株表达基质金属蛋白酶并活化细胞表皮生长因子受体促进细胞的增殖。
    综上所述，本研究表明TFFⅦa及TFFⅦaFⅩa复合物均能活化SW 620细胞PAR2，上调IL8表达，从而促进细胞增殖及迁移能力。而此过程中的相关信号转导机制有待进一步研究。
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