作者：于昕 刘向群 陈焕芹 马文健 陈效安    作者单位：(山东大学齐鲁医院干部保健科，山东济南250012)
【摘要】  目的观察黄芩苷对动脉粥样硬化(AS)模型大鼠的凝血酶激活纤溶抑制物(TAFI)水平及血脂、凝血纤溶指标的影响，探讨黄芩苷在干预AS进程中的机制。方法40只健康雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组、模型组、黄芩苷治疗组、辛伐他汀组，每组10只。正常对照组给予普通饲料喂养，其余3组在给予高脂饲料喂养的基础上行主动脉球囊损伤术，喂养4个月，以复制大鼠AS模型。用全自动生化仪测定血浆总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，用全自动血凝仪测定凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(Fib)，发色底物法测定血浆TAFI的活性。结果与正常对照组相比，其余各组大鼠的TC、TG、LDL-C、Fib和TAFI活性均明显升高 (P<0.01或P<0.05)，PT、APTT明显缩短(P<0.01或P<0.05);实验结束时，与模型组相比，黄芩苷治疗组与辛伐他汀组的TC、TG、LDL-C、Fib和TAFI活性明显低于模型组(P<0.01或P<0.05)，PT、APTT明显延长(P<0.01或P<0.05);与辛伐他汀组比较，黄芩苷治疗组TC、TG、LDL-C、Fib、PT、APTT改善程度稍低(P<0.05)，而TAFI活性则无明显统计学差异(P>0.05)。结论黄芩苷可能通过降血脂、改善凝血纤溶系统平衡、下调TAFI水平等途径干预了AS的形成。
【关键词】  动脉硬化;血脂;纤维蛋白原;凝血酶激活的纤溶抑制物;黄芩苷
　【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects and possible mechanisms of baicalin on the atherosclerosis (AS) rats.Methods40 healthy Wistar rats were divided randomly into four groups: normal control group (n=10) and fed with normal diet, AS model group (n=10), baicalin therapy group (n=10), and positivecontrolgroup (n=10), rats in the last three groups were fed with hypercholesterol dietfor 16 weeks.Treated with bacalin 100 mg· kg-1·d-1， and simvastatin 5 mg· kg-1·d-1 additionally for 16 weeks in baicalin therapy and positivecontrol groups respectively from the second week.Serum lipids, blood coagulation, fibrinolysis and thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI) were detected with standard enzymatic assays.ResultsThe levels of total cholesterol (TC), triglycerides (TG), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), prothrombin time (PT),activated partial thromboplastin time (APTT), fibrinogen (Fib) and TAFI in the three model groups were higher than those of normal control group (P<0.01 or<0.05).After treatment, the levels of serum lipids and Fib, TAFI in baicalin group were lower than those in non-drug treatment group obviously (P<0.01 or P<0.05), and the levels of PT, APTT were longer too (P<0.01 or P<0.05).ConclusionsBaicalin improves AS not only by decreasing levels of serum lipids, the activity of blood clotting system and TAFI, also enhancing the activity of fibrinolysis system
　　.
　　【Key words】Atherosclerosis; Serum lipids; Fibrinogen; Thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor; Baicalin
　　研究显示，凝血系统活性增加、纤维蛋白溶解系统活性降低〔1〕以及凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)的过度激活与动脉粥样硬化(AS)的发生发展密切相关，是促进AS斑块形成和发展的重要因素。黄芩苷是从唇形科植物黄芩的干燥根中提取的一种黄酮类化合物，具有抑制血管平滑肌的增殖及抗炎、抗氧化、调节免疫等作用，从理论上来讲其可作为预防AS的有效天然药物应用。本研究通过观察黄芩苷对大鼠血脂、凝血、纤溶及TAFI的影响，探讨其干预AS发生、发展过程中的机制。
　　1材料与方法
　　1.1材料及主要仪器
       健康雄性的Wistar大鼠，8周龄，体重300～400 g，由山东大学实验动物中心提供;黄芩苷：购自四川协力制药有限公司，批号：国药准字20053191，相对分子质量为446.35，用生理盐水配制成25 mg/ml，于棕色容器中密闭储存;辛伐他汀：杭州默沙东制药有限公司生产，批号：国药准字H19990366;酶标仪：山东大学齐鲁医院中心实验室提供(Model 550型，美国BIO-RAD公司生产);TAFI 发色底物试剂盒：美国ADI公司生产，购自上海船夫生物科技有限公司。大鼠ELISA试剂盒，购自BPB Biomedicals公司。
　　1.2方法
　　1.2.1高脂饮食配方按照3%胆固醇、0.5%胆酸钠、5%白糖、10%猪油、5%蛋黄粉、76.5%标准饲料比例配制而成。
　　1.2.2造模及给药采用高脂饮食加球囊损伤加维生素D3注射方法建立大鼠AS模型〔2〕。Wistar大鼠40只，先用普通饲料适应性喂养1 w后随机分配到正常对照组、模型组、黄芩苷治疗组和辛伐他汀组，每组10只。正常对照组继续给予普通饲料喂养;其余30只用高脂饲料喂养(15～25 g/d)，与此同时，在实验开始时右下肢肌肉注射维生素D3针剂(30万U/kg体重)，每隔30天重复1次。正常对照组大鼠在实验开始第7天行假主动脉球囊损伤术。模型组、黄芩苷组和辛伐他汀组大鼠在实验开始7 d后给予主动脉球囊损伤术。适应性饲养1 w后，正常对照组和模型组给予每天1次生理盐水5 ml灌胃，黄芩苷治疗组给予黄芩苷100 mg·kg-1·d-1灌胃，1次/d。辛伐他汀组给予辛伐他汀5 mg·kg-1·d-1灌胃，1次/d。
　　1.3血脂指标检测于实验开始第16周进行采血，采血前禁食12 h，均从颈动脉抽取空腹血3 ml，静置1 h后3 000 r/min离心15 min，取血清于-80℃冻存待用。三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平，采用全自动生化分析仪测定。
　　1.4凝血和纤溶活性指标的测定分别留取血样2.7 ml，立即放入3.2%枸橼酸钠硅化管中(9∶1容积抗凝)，4℃ 3 000 r/min离心15 min，分离血浆后即刻测定凝血时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(Fib)。
　　1.5TAFI活性的测定经美国Bio-RAD Model 550全自动酶标仪测定，步骤严格按照说明书进行，采用发色底物法。
　　1.6统计学方法数据用x±s表示，采用方差分析，各组间两两比较采用SNK法，由SPSS13.0软件完成。
　　2结果
　　2.1实验16 w后各组TG、TC、HDL-C、LDL-C水平比较与正常对照组比较，模型组、黄芩苷组和辛伐他汀组TG、TC、LDL-C均明显升高(P<0.05 或P<0.01);HDL-C明显降低(P<0.05 或P<0.01);与模型组比较，黄芩苷组和辛伐他汀组TG、TC、LDL-C水平均明显降低(P<0.05或P<0.01)，HDL-C明显升高(P<0.05或P<0.01);辛伐他汀组TG、TC、LDL-C降低程度及HDL-C升高程度均大于黄芩苷组(P<0.05)，见表1。表1各组血脂水平
　　2.2实验16 w后各组TAFI及凝血纤溶指标比较与正常对照组比较，模型组、黄芩苷组和辛伐他汀组的PT和APTT水平均明显缩短(P<0.05或P<0.01)，而Fib水平明显升高(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较，黄芩苷组和辛伐他汀组PT和APTT水平均明显延长(P<0.05或P<0.01)，而Fib水平明显降低(P<0.01);而且辛伐他汀组PT和APTT 水平的延长程度及Fib水平的降低程度大于黄芩苷组(P<0.05);与正常对照组比较，模型组、黄芩苷组和辛伐他汀组的血浆中TAFI水平均明显升高(P<0.05 或P<0.01);与模型组比较，黄芩苷组和辛伐他汀组TAFI水平均明显降低(P<0.01);黄芩苷组与辛伐他汀组间比较无差异(P>0.05)。见表2。表2各组凝血纤溶指标及TAFI水平
　　3讨论
　　郭延松等〔2〕根据脂质浸润学说、钙超载学说、内皮损伤学说、血栓形成学说等，用3种方法成功地建立大鼠AS模型。他们认为，高脂饲料不易形成斑块，只形成高脂血症，高脂饲料+维生素D负荷可形成以血管平滑肌细胞增生为主的纤维增生性动脉硬化，高脂饲料+维生素D负荷+内皮球囊损伤术，可形成较成熟的斑块。刘利妍等〔3〕研究发现，应用高脂饲料+维生素D负荷+内皮球囊损伤的方法喂养大鼠4月，可成功复制AS模型，因此，用高脂饲料+维生素D负荷+内皮球囊损伤的方法复制AS模型是成熟可靠的。TAFI是近年来新发现的由肝脏合成的羧肽酶样活性蛋白，在血循环中以无活性的酶原形式存在。在体内TAFI可被凝血酶、凝血酶-凝血酶调节蛋白(TM)、纤溶酶、胰蛋白酶激活(TAFIa)，发挥抗纤溶作用，在凝血和纤溶系统之间平衡的精细调节中起到了重要作用。刘利妍等〔3〕研究发现，在AS发展过程中，随着AS病变的加重，TAFI水平逐渐升高，说明TAFI参与AS的形成。本研究显示，与正常对照组比较，动脉粥样硬化模型组大鼠的血浆中　TAFI水平均明显升高，TG、TC、LDL-C水平均明显升高，HDL-C明显降低;凝血指标PT和APTT水平明显缩短，Fib水平升高。Schroeder等〔4〕对冠状动脉疾病患者和对照组的研究发现，冠心病患者的静脉和冠状动脉的TAFI水平比对照组升高。TAFI主要于纤维蛋白羧基端上精氨酸或赖氨酸部位进行剪切，使纤溶酶失去与纤维蛋白作用的位点，从而抑制纤溶活性，导致溶栓时间延长，增加了血栓形成的危险。当体内TAFI血　浆浓度>129 nmol/L时，血栓危险性增加一倍。研究报道血浆TAFI 浓度与血浆纤维蛋白原和蛋白S显著相关，推测TAFI通过削弱纤溶作用，导致纤维蛋白沉积，从而增加冠状动脉疾病的危险性〔5〕。
　　沈涛等〔6〕报道，实验性高TG血症大鼠凝血系统活性增加，纤维蛋白溶解系统活性降低，使血液呈高凝状态。纤溶系统是机体重要的抗血栓成分，其所执行的使Fib发生酶性降解的功能是机体重要的防御功能，对于平衡止血机制随时清除血管壁上沉积的Fib起着关键作用。Fib为急性冠脉事件的独立危险因子，是血液高凝状态及血栓形成的危险因素7〕，它除了本身作为斑块组成成分参与内膜增厚外，还可以为斑块形成过程中细胞的黏附、迁移和增殖提供临时性支架，促使AS，导致动脉血栓形成。Fib/纤维蛋白以及降解产物具有众多的能与内皮细胞、血小板、单核细胞、淋巴细胞等相互作用的位点(基序)，通过介导炎症反应，参与血栓形成以及引起血管内皮损伤和血液流变学的改变，在AS发生发展中起了非常重要的作用〔8〕。当血液纤溶活性下降，血液中Fib含量增加，而Fib及其产物纤维蛋白可促进平滑肌细胞的迁移与增殖，破坏血管内皮细胞的结构和功能，使其通透性增加，引起纤维蛋白沉着甚至血栓形成，血浆脂蛋白渗入内膜，长期纤维蛋白的慢性沉积会导致血管的反复损伤，有利于斑块的生长，这可能是AS 发展的一个重要原因〔9〕。故降低血液纤维蛋白原水平、恢复凝血纤溶系统的生理活性，有可能成为预防动脉粥样硬化的治疗靶点，对动脉粥样硬化的防治有重要意义。本研究显示黄芩苷可预防AS的发生和发展，有抗AS的作用，AS机制可能为：①黄芩苷能够降低AS大鼠血清中的TC、LDL水平，升高HDL-C水平，起到抗AS的作用;②黄芩苷能使AS大鼠血清中TAFI水平下调，可以恢复机体的凝血纤溶系统的平衡，进而使血液中Fib水平下降，起到延缓AS进程的作用。黄芩苷作为一种天然药物，具有毒性低、副作用小等优点，需要进一步的基础实验研究和大规模的临床试验研究进一步明确其在防治AS的作用机制及临床应用价值，为AS及其相关疾病的防治开辟新的途径。
【参考文献】
  　 1Rosenfeld ME.An overview of the evolution of the atherosclerotic plaque：from fatty streak to plaque rupture and thrombosis〔J〕.Z Kardiol,2000;89(suppl 7):2-6.

　　2郭延松,吴宗贵,杨军柯,等.三种大鼠动脉粥样硬化模型复制方法的比较〔J〕.中国动脉硬化杂志,2003;11(5):465-9.

　　3刘利妍,刘向群,陈焕芹,等.大鼠动脉粥样硬化形成过程中TAFI水平变化及作用机制〔J〕.山东大学学报(医学版),2007;45(8)：787-91.

　　4Schroeder V,Chatter T,Mehta H,et al.Thrombin activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI) levels in patients with coronary artery disease investigated by angiography〔J〕.Thromb Haemost,2002;88(6):1020-5.

　　5Silveira A，Schatteman K,Goossens F,et al.Plasma procarboxypeptidase U in men with symptomatic coronary artery disease〔J〕.Thromb Haemost,2000;84(3):364-8.

　　6沈涛,白怀,刘秉文,等.实验性高三酰甘油血症大鼠凝血和纤溶的变化〔J〕.中国动脉硬化杂志,2002;10(3):199-202.

　　7Danesh J,Lewington S,Dphil G.Plasma fibrinogen level and the risk of major cardiovascular diseases and nonvascular mortality：an individual participantmeta-analysis〔J〕.JAMA,2005;294(14)：1799-809.

　　8Yakovlev S,Zhang L,Ugarova T,et al.Interaction of fibrin(ogen) with leukocyte receptor αMβ2 (Mac-1)：further characterization and identification of a novel binding region within the central domain of the fibrinogen γ-Module〔J〕.Biochemistry,2005;44(2):617-26.

　　9Libby P,Aikawa M，Jain MK,et al.Vascular endothelium and atherosclerosis〔M〕.Handb Exp Pharmacol,2006;176(Pt 2):285-306.